IPS诱导肠类器官培养可分为三个主要阶段：人多能干细胞的培养、内胚层分化及中/后肠模式化诱导，以及类器官的培养。以下将详细讨论第二阶段——内胚层分化及中/后肠模式化诱导。

一、前期准备

1. 试剂与设备

- 细胞来源：H1/H9hESC或患者来源的iPSCs。
- 培养基：人多能干细胞培养基(abs9403)、RPMI1640(abs9484)。
- 消化液：人多能干细胞消化液(abs9409)。
- 培养基添加剂：L-丙氨酰-L-谷氨酰胺溶液(2mM)(abs9295)、双抗(abs9244)。
- 生长因子：ActivinA(100ng/mL)(abs05801)、FGF4(500ng/mL)(abs06269)、WNT3a(500ng/mL)(abs05632)。
- 基质胶：即用型基质胶（培养板包被）(abs9410)、类器官专用基质胶(abs9495)。
- 血清：透析胎牛血清(abs945)。
- 关键设备：表面培养皿、立体显微镜、无菌手术刀、预冷微量离心管。

2. 试剂配制

- 内胚层分化培养基：
- 第一天：RPMI1640+L-丙氨酰-L-谷氨酰胺溶液(2mM)+双抗(1%)+ActivinA(100ng/mL)。
- 第二天：第一天配方+透析胎牛血清(0.2%)。
- 第三天：第一天配方+透析胎牛血清(2%)。
- 中/后肠分化培养基：
- RPMI1640+透析胎牛血清(2%)+FGF4(500ng/mL)+WNT3a(500ng/mL)。

二、hPSCs传代与铺板

1. 细胞传代（耗时约2小时）

- 使用人多能干细胞消化液消化hPSCs至边缘卷起。
- 用细胞刮刀轻柔剥离细胞团，反复吹打至1-2mm大小。
- 按1:6比例接种至Matrigel包被的24孔板中（每孔约5000个细胞团）。
- 轻敲培养板使细胞均匀分布，并在37°C下培养过夜。

2. 细胞扩增至85-90%融合（3-4天）

- 每日更换人多能干细胞培养基，观察细胞密度。
- 需关注：过高密度会导致自发分化，过低密度则分化效率低，需重新铺板。

三、内胚层分化（3天）

1. 第一天：吸除人多能干细胞培养基，加入无血清的内胚层培养基，培养24小时。
2. 第二天：更换为含0.2%透析胎牛血清的内胚层培养基，继续培养24小时。
3. 第三天：更换为含2%透析胎牛血清的内胚层培养基，培养24小时。
4. 验证分化效率（可选）：通过免疫染色检测FOXA2/SOX17双阳性细胞，效率应达到85-90%。

四、中/后肠模式化（3-4天）

1. 诱导球状体形成

- 吸除内胚层培养基，加入中/后肠分化培养基，每日更换。
- 48小时后：使用立体显微镜观察上皮增厚，72-96小时球状体将脱离单层细胞。

2. 收集球状体

- 用200μL枪头收集游离球状体，每管约50个，置于冰上备用。

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