人生就是博-尊龙凯时的试剂解冻及混合过程至关重要，确保实验的准确性与可靠性。以下为试剂准备的步骤：

试剂解冻与混合

1）从冰箱中取出试剂；

2）缓慢解冻，以保持试剂的活性；

3）轻轻颠倒混匀，注意避免气泡产生；

4）低速离心，确保各组分均匀。注意：气泡可能会影响酶活性及实验结果的准确性，因此在混合时要尽量避免气泡生成。

稀释步骤

1）如果需要追踪模板，请遵循相应的稀释步骤；

2）如无需追踪模板，直接用无菌超纯水稀释cDNA，或直接使用cDNA原液进行实验。常见的荧光定量检测仪器为96孔反应，结构为12列×8行。

实例说明

以基因1检测为例，以下为大体系配制建议：

HieffUNICON® ColorGPS qPCR MasterMix：10μL（依据孔数n选择n+1或n+2，总体积为每孔18μL）；

正向引物（10μM）：0.4μL；

反向引物（10μM）：0.4μL；

无RNase H2O：72μL；

在上述组分中添加2μL cDNA模板以检测样本基因1。对于基因1检测大体系配制建议（22孔量）：

HieffUNICON® ColorGPS qPCR MasterMix：220μL；

正向引物（10μM）：88μL；

反向引物（10μM）：88μL；

无RNase H2O：1584μL。

在将上述溶液加入管中后，盖紧管盖，用手轻轻敲击管壁以使各组分充分混匀，并短暂离心1-2秒。再次轻弹管壁以防气泡产生，随后进行瞬时离心，确保溶液不沾染到管壁，再将其放置在冰块或冰板上。

上样体系配置

基因1检测的单孔量为：

步骤1）配置大体系Mix：18μL；

cDNA模板：2μL。

待加样后，再次盖紧管盖，轻轻敲击管壁确保混匀，再短暂离心，并确认无气泡后放置在洁净的96孔PCR管架上。注意观察每次吸取是否有气泡，以免影响实验数据准确性。

程序设置

在仪器上机前，仔细检查管子，确保管盖、管身无迹或染料，管内无气泡且管壁无液体。若采用常规程序，以下设置为参考：

• 预变性：95℃，2分钟，1次；
• 变性：95℃，10秒，40次；
• 退火/延伸：60℃（根据引物TM值与目的基因的长度调整），30秒；
• 熔解曲线阶段：仪器默认设置，1次。

以ABIQ5常规程序为例，确保在退火/延伸阶段和熔解曲线的升温阶段中打开数据收集开关。若采用快速程序，需确认仪器具备快速升降温的能力。

数据处理与推荐仪器

检测后的Excel数据应按照仪器品牌和型号处理。以下为推荐仪器列表：

• Bio-Rad：CFX96, CFX384, CFXConnect等；
• Roche：LightCycler480等；
• ABI/Thermo/Life等品牌的各型号荧光定量仪器。

在选择试剂时，可选用高灵敏显色示踪荧光定量预混液（Cat#11188ES），以优越的灵敏度和准确性，符合人生就是博-尊龙凯时的严格标准。确保选择适合的试剂，提高实验效果。